فناوری نانو – سنجش برونتنی MTS برای اندازهگیری اثر سمیتسلولی نانوذرات
"Nanotechnologies — In vitro MTS assay for measuring the cytotoxic effect of nanoparticles"
شماره:
۲۳۱۰۸
سال انتشار:
1400
حوزه فناوری نانو از طریق تولید مواد جدید محصولات و کاربردها به سرعت در حال پیشرفت است. همزمان سوالات زیادی در مورد تأثیر بالقوه برخی از این مواد بر سلامت انسان و محیط زیست مطرح شده است. در سطح بینالمللی یک برنامه تحقیقاتی بزرگ برای درک بهتر و تعیین کمیت پتانسیل مخاطرات در حال انجام است. همچنین مواد شیمیایی مورد استفاده در پوشش سطحی نانوذرات در فرآوری یا در محصولات میتوانند حتی به دلیل نسبت بالای سطح به حجم آنها بر سمیت نانوذرات تأثیر بیشتری بگذارند.
سیستمهای سلولی یکی از عناصر اساسی سیستمهای زیستی زنده هستند احتمال دارد پایش پاسخ سمیت سیستمهای مدل سلولی به مواجهه با نانوذرات درک عمیقی را از حالتهای عمل نانوذرات و اینکه کدام یک از آنها برای بررسی بیشتر ارزیابی ریسک مورد نیاز است فراهم آورد. در سال ۲۰۰۸ عدهای از محققان بینالمللی نتیجه گرفتند که برخی از نتایج منتشر شده از سمیت نانومواد توسط آزمایشگاههای دیگر قابل تکرار نیست و آنکه درستی و تکرارپذیری آزمونهای نانوتوکسیکولوژی لازم است. در نتیجه «معاهده بینالمللی یکسانسازی NanoEHS » (IAHN) با هدف توسعه پروتکل های آزمون که سمیت و برهم کنشهای زیستی نانوذرات را در سیستمهای سلولی به درستی ارزیابی کنند و اینکه این نتایج در هر آزمایشگاهی تکرارپذیر باشد منعقد شد. IANH مشخصه یابی راند رابین (مقایسه بین آزمایشگاهی روش آزمون) توزیع اندازه ذرات در تعلیقههای مایع و برهم کنشهای برون تنی نانومواد بـا سلولها را با چندین مورد سنجش سمیت سلولی رایج (پیوست الف) انجام داد. این گروه تعدادی از عوامل را که باعث افزایش متغیرها میشوند شناسایی کرده و فنون کاهش آنها را توسعه دادند. تحقیقات سرمایهگذاری شده توسط موسسه NIEHS NanoGo آمریکا، ارزیابیهای بیشتری در مورد برخی از این پروتکلها به خصوص پروتکل ارزیابی ۳( ۴ ۵ دی متیل تیازول -۲- ایل) ۵-۳- کربوکسی متوکسی فنیل)-۲- (۴- سولفوفنيل تترازولیم (MITS) انجام داد. تیم سوم پروتکل IANH را توسعه داده و آزمایشهایی را انجام دادند که در آن از یک چیدمان سامانمند پلیت برای دستیابی به آنالیز بهبودیافته و ثبات نتایج استفاده شده است پیوست (ب) نکته مهم آن است که در هر یک از این پروتکلها از آزمون فیمابین آزمایشگاههای متعدد برای شناسایی منابع متغیرها و بهبود پروتکلهای سنجش استفاده شده است.
این استاندارد روشی برای سنجش برون تنی زنده مانی سلول با سنجش MTS است. در این سنجش یک تغییر رنگ اوج جذب در طول موج ۴۹۰ نانومتر در یک چاهک کشت به دلیل تولید محصول فورمازان در حضور آنزیمهای ردوکتاز سیتوپلاسمیک تولید می.شود به طور کلی تغییرات در شدت جذب مستقیماً با تعداد سلول متناسب است. اگرچه شرایط سنجشی که فعالیت ردوکتاز یا در دسترس بودن واکنشگر را تغییر میدهد میتواند منجر به تغییرات رنگی شود که مستقیماً ناشی از تغییر در زنده مانی سلول نیست یعنی تعداد سلول واکنشگرهای MTS مستقیما به چاهک کشت سلول افزوده میشوند که به سرعت ارزشیابی پتانسیل سمیت ذاتی نانوذرات را امکان پذیر میسازد با توجه به پتانسیل اثرات تداخلی که میتواند با نانوذرات و سنجشهای رنگی ایجاد شود این نکته مهم است که آزمایشهای کنترلی با نانوذرات و واکنشگرهای MTS قبل از پذیرش نتایج سنجش انجام شود مشاهده مستقیم میکروسکوپی سلولها پس از تیمار نیز یک روش متعامد برای صحهگذاری نتیجه سنجش MTS را فراهم میآورد. پروتکل نرمال شده (بهنجار شده) ارائه شده در این استاندارد محدود به انواع سلولهای چسبنده است اما می تواند برای استفاده در سلولهای تعلیقهای اصلاح شود.
اندازهگیری سمیت با این سنجش در ردیف اول اندازهگیری اثرات نانوذرات بر روی سیستمهای سلولی منفرد است. روش نرمال شده که در این استاندارد ارائه شده بر پایه به پروتکل سنجش MTS توضیح داده شده در بالا است.
در نتیجه تفاوت بین سیستمهای آزمایشی برخی از قسمتهای پروتکل نرمال شده، شامل مراحل اختیاری است که در به مطالعه بین آزمایشگاهی ارائه شده است.
از چندین روش میتوان برای تعیین زنده مانی سلول استفاده کرد از جمله MTS ۵۰۴۱-۳-دی متیل تیازول-۲- ایل-۵،۲-دی فنیل تیازولیوم بروماید (MIT) ،۳۲ بیس (۲-متوکسی-۴-نیترو – ۵- سولفوفنیل) – 2H- تترازولیم-۵-کربوکسانیلید) (XTT) لاکتات دهیدروژناز (LD11) اکسکلوژن تریپان بلو و سنجش نوترال رد از سنجش MTS در یک مشخصهیابی راند رابین چند گروهه استفاده شده است سنجش MTS یک نسخه بهبودیافته از آزمون MTT است و یک مشخصه یابی ساده با توان عملیاتی بالا برای زنده مانی سلول را ارائه میدهد چگالی نوری محلول سنجش MTS با کاهش عملکرد آنزیمهای سلولی در سلولهای زنده افزایش مییابد.
به منظور تعیین مبنای چگالی نوری زنده مانی سلولی برای سلولهای تیمار نشده و برای تایید این که آیا سلولها پاسخ مورد انتظار به نانوذرات غیرسمی شناخته شده مواد شیمیایی سمی و نانوذرات سمی اندازهگیری شده با این آزمون را دارند آزمایشهای کنترلی مورد نیاز است علاوه بر این مهم است که تعیین شود آیا نانوذرات با خوانش نوری سنجش و ارزیابی صحهگذاری نشده پتانسیل پاسخ سمیت سلولی نانوذرات تداخل دارند.
توجه به این نکته مهم است که سنجش MTS شرح داده شده در این استاندارد یکی از آزمونهای متعدد تجاری در دسترس برای ارزیابی سمیت سلولی نانومواد است اگر چه آزمونهایی مانند آزمون LDH که یکپارچگی غشای پلاسمایی را ارزیابی میکند آزمون ATP که متابولیسم انرژی را ارزیابی میکند و آزمون BrdU برای سنتز DNA در اینجا مورد بحث قرار نگرفته است نتایج حاصل از این آزمونها علاوه بـر سنجش MTS اجازه میدهد تا یک ارزشیابی جامعتر از تاثیر کلی نانوذرات بر سلولها انجام شود.
هدف از تدوین این استاندارد
هدف از تدوین این استاندارد، تعیین روشی برای ارزشیابی اثرات نانواشیاء و کلوخهها و انبوهههای آنها (NOAA) در زنده مانی سلول با استفاده از سنجش MTS است طراحی آزمون شامل اجرای الزامات و آزمایشها کنترلی برای مدیریت و مشخص کردن متغیرها در نتایج آزمون است.
شماره استاندارد ملی ایران:
۲۳۱۰۸
سال انتشار:
1400
فناوری نانو – سنجش برونتنی MTS برای اندازهگیری اثر سمیتسلولی نانوذرات
"Nanotechnologies — In vitro MTS assay for measuring the cytotoxic effect of nanoparticles"
حوزه فناوری نانو از طریق تولید مواد جدید محصولات و کاربردها به سرعت در حال پیشرفت است. همزمان سوالات زیادی در مورد تأثیر بالقوه برخی از این مواد بر سلامت انسان و محیط زیست مطرح شده است. در سطح بینالمللی یک برنامه تحقیقاتی بزرگ برای درک بهتر و تعیین کمیت پتانسیل مخاطرات در حال انجام است. همچنین مواد شیمیایی مورد استفاده در پوشش سطحی نانوذرات در فرآوری یا در محصولات میتوانند حتی به دلیل نسبت بالای سطح به حجم آنها بر سمیت نانوذرات تأثیر بیشتری بگذارند.
سیستمهای سلولی یکی از عناصر اساسی سیستمهای زیستی زنده هستند احتمال دارد پایش پاسخ سمیت سیستمهای مدل سلولی به مواجهه با نانوذرات درک عمیقی را از حالتهای عمل نانوذرات و اینکه کدام یک از آنها برای بررسی بیشتر ارزیابی ریسک مورد نیاز است فراهم آورد. در سال ۲۰۰۸ عدهای از محققان بینالمللی نتیجه گرفتند که برخی از نتایج منتشر شده از سمیت نانومواد توسط آزمایشگاههای دیگر قابل تکرار نیست و آنکه درستی و تکرارپذیری آزمونهای نانوتوکسیکولوژی لازم است. در نتیجه «معاهده بینالمللی یکسانسازی NanoEHS » (IAHN) با هدف توسعه پروتکل های آزمون که سمیت و برهم کنشهای زیستی نانوذرات را در سیستمهای سلولی به درستی ارزیابی کنند و اینکه این نتایج در هر آزمایشگاهی تکرارپذیر باشد منعقد شد. IANH مشخصه یابی راند رابین (مقایسه بین آزمایشگاهی روش آزمون) توزیع اندازه ذرات در تعلیقههای مایع و برهم کنشهای برون تنی نانومواد بـا سلولها را با چندین مورد سنجش سمیت سلولی رایج (پیوست الف) انجام داد. این گروه تعدادی از عوامل را که باعث افزایش متغیرها میشوند شناسایی کرده و فنون کاهش آنها را توسعه دادند. تحقیقات سرمایهگذاری شده توسط موسسه NIEHS NanoGo آمریکا، ارزیابیهای بیشتری در مورد برخی از این پروتکلها به خصوص پروتکل ارزیابی ۳( ۴ ۵ دی متیل تیازول -۲- ایل) ۵-۳- کربوکسی متوکسی فنیل)-۲- (۴- سولفوفنيل تترازولیم (MITS) انجام داد. تیم سوم پروتکل IANH را توسعه داده و آزمایشهایی را انجام دادند که در آن از یک چیدمان سامانمند پلیت برای دستیابی به آنالیز بهبودیافته و ثبات نتایج استفاده شده است پیوست (ب) نکته مهم آن است که در هر یک از این پروتکلها از آزمون فیمابین آزمایشگاههای متعدد برای شناسایی منابع متغیرها و بهبود پروتکلهای سنجش استفاده شده است.
این استاندارد روشی برای سنجش برون تنی زنده مانی سلول با سنجش MTS است. در این سنجش یک تغییر رنگ اوج جذب در طول موج ۴۹۰ نانومتر در یک چاهک کشت به دلیل تولید محصول فورمازان در حضور آنزیمهای ردوکتاز سیتوپلاسمیک تولید می.شود به طور کلی تغییرات در شدت جذب مستقیماً با تعداد سلول متناسب است. اگرچه شرایط سنجشی که فعالیت ردوکتاز یا در دسترس بودن واکنشگر را تغییر میدهد میتواند منجر به تغییرات رنگی شود که مستقیماً ناشی از تغییر در زنده مانی سلول نیست یعنی تعداد سلول واکنشگرهای MTS مستقیما به چاهک کشت سلول افزوده میشوند که به سرعت ارزشیابی پتانسیل سمیت ذاتی نانوذرات را امکان پذیر میسازد با توجه به پتانسیل اثرات تداخلی که میتواند با نانوذرات و سنجشهای رنگی ایجاد شود این نکته مهم است که آزمایشهای کنترلی با نانوذرات و واکنشگرهای MTS قبل از پذیرش نتایج سنجش انجام شود مشاهده مستقیم میکروسکوپی سلولها پس از تیمار نیز یک روش متعامد برای صحهگذاری نتیجه سنجش MTS را فراهم میآورد. پروتکل نرمال شده (بهنجار شده) ارائه شده در این استاندارد محدود به انواع سلولهای چسبنده است اما می تواند برای استفاده در سلولهای تعلیقهای اصلاح شود.
اندازهگیری سمیت با این سنجش در ردیف اول اندازهگیری اثرات نانوذرات بر روی سیستمهای سلولی منفرد است. روش نرمال شده که در این استاندارد ارائه شده بر پایه به پروتکل سنجش MTS توضیح داده شده در بالا است.
در نتیجه تفاوت بین سیستمهای آزمایشی برخی از قسمتهای پروتکل نرمال شده، شامل مراحل اختیاری است که در به مطالعه بین آزمایشگاهی ارائه شده است.
از چندین روش میتوان برای تعیین زنده مانی سلول استفاده کرد از جمله MTS ۵۰۴۱-۳-دی متیل تیازول-۲- ایل-۵،۲-دی فنیل تیازولیوم بروماید (MIT) ،۳۲ بیس (۲-متوکسی-۴-نیترو – ۵- سولفوفنیل) – 2H- تترازولیم-۵-کربوکسانیلید) (XTT) لاکتات دهیدروژناز (LD11) اکسکلوژن تریپان بلو و سنجش نوترال رد از سنجش MTS در یک مشخصهیابی راند رابین چند گروهه استفاده شده است سنجش MTS یک نسخه بهبودیافته از آزمون MTT است و یک مشخصه یابی ساده با توان عملیاتی بالا برای زنده مانی سلول را ارائه میدهد چگالی نوری محلول سنجش MTS با کاهش عملکرد آنزیمهای سلولی در سلولهای زنده افزایش مییابد.
به منظور تعیین مبنای چگالی نوری زنده مانی سلولی برای سلولهای تیمار نشده و برای تایید این که آیا سلولها پاسخ مورد انتظار به نانوذرات غیرسمی شناخته شده مواد شیمیایی سمی و نانوذرات سمی اندازهگیری شده با این آزمون را دارند آزمایشهای کنترلی مورد نیاز است علاوه بر این مهم است که تعیین شود آیا نانوذرات با خوانش نوری سنجش و ارزیابی صحهگذاری نشده پتانسیل پاسخ سمیت سلولی نانوذرات تداخل دارند.
توجه به این نکته مهم است که سنجش MTS شرح داده شده در این استاندارد یکی از آزمونهای متعدد تجاری در دسترس برای ارزیابی سمیت سلولی نانومواد است اگر چه آزمونهایی مانند آزمون LDH که یکپارچگی غشای پلاسمایی را ارزیابی میکند آزمون ATP که متابولیسم انرژی را ارزیابی میکند و آزمون BrdU برای سنتز DNA در اینجا مورد بحث قرار نگرفته است نتایج حاصل از این آزمونها علاوه بـر سنجش MTS اجازه میدهد تا یک ارزشیابی جامعتر از تاثیر کلی نانوذرات بر سلولها انجام شود.
هدف از تدوین این استاندارد
هدف از تدوین این استاندارد، تعیین روشی برای ارزشیابی اثرات نانواشیاء و کلوخهها و انبوهههای آنها (NOAA) در زنده مانی سلول با استفاده از سنجش MTS است طراحی آزمون شامل اجرای الزامات و آزمایشها کنترلی برای مدیریت و مشخص کردن متغیرها در نتایج آزمون است.